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    本案公開一種分析一產品中的一化合物之化學圖資之方法，化合物包括醌類化合物、二苯乙烯類化合物、黃酮類化合物及/或生物鹼類化合物，醌類包括大黃酸、番瀉苷A、蘆薈大黃素，二苯乙烯類包括白藜蘆醇苷，黃酮類包括黃芩苷，生物鹼類包括小檗鹼及黃藤素。該分析方法是(a)以高效液相層析法層析該產品及對應該化合物之一標準品；(b)比較該產品及該標準品之高效液相層析圖譜；以及(c)根據比較結果來分析該產品之該化學圖資。
    公开号:TW201300776A
    申请号:TW100122952
    申请日:2011-06-29
    公开日:2013-01-01
    发明作者:Fang-Rong Chang；Tung-Ting Wu；Yang-Chang Wu
    申请人:Univ Kaohsiung Medical；
    IPC主号:G01N30-00
    专利说明:
    用於檢測醌類、二苯乙烯類、黃酮類及生物鹼類組合物之化學圖資分析
    本案係關於一種生物活性物質之化學圖資分析，尤其係關於一種用於檢測醌類、二苯乙烯類、黃酮類及生物鹼類組合物之化學圖資分析。
    大黃(Rheum palmatum)屬於寥科大黃屬多年生草本植物，在中醫上常被用於通便瀉火藥物，其根莖含有蔥菎類化合物，例如大黃素、大黃酸等，而被用於減肥瘦身之藥物成分。大黃的葉部則包含番瀉葉甙。大黃中的活性化合物包括番瀉苷B、番瀉苷A、蘆薈大黃素、大黃苷、大黃素、大黃根酚等。
    黃芩(Scutellaria baicalensis)屬於唇形科黃芩屬多年生草本植物。其根部在中醫藥理上具有清熱燥濕、瀉火解讀、止血、安胎等功效，亦可用於治療上呼吸道感染及腸胃炎。黃芩的活性化合物包括黃芩苷、木蝴蝶素A-葡萄糖苷酸、黃芩素-7-O-葡萄糖苷酸、黃芩苷元、黃芩素、木蝴蝶素A(oroxylin A)等。
    黃連(Coptidis rhizome)屬於毛莨科多年生草本植物，可用於胃腸暑濕、瀉痢嘔吐，其根莖部具有黃連素(berberine)，黃連素之鹽酸鹽形式已被用於治療細菌性痢疾及腸胃炎，黃連中還被萃取出棕櫚鹼，用於治療黃疸、痢疾、高血壓、發炎及肝臟疾病等。黃連的活性化合物則包括小檗鹼、非洲防己鹼、藥根鹼、表小檗鹼、黃連鹼及黃藤素等。
    包含大黃、黃芩及黃連的中藥複方最著名的是三黃瀉心湯，其具有苦寒瀉火、清泄三焦功能，主治心氣不足、吐血衂血等症。此外亦具有抗發炎、高血壓、抗癌、抗病毒及腸道保護之功效。但由於三黃瀉心湯為中藥複方，內容成分複雜，不易管控其品質。再者，目前市面上也尚未出現能夠鑑定宣稱含有大黃、黃芩及/或黃連的中藥複方、中藥單方或保健食品之技術。因此，能夠快速、有效地分析、鑑定前述中藥產品，並獲得中藥產品的化學圖資將成為檢測之利器。
    本案申請人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案，能夠克服先前技術的不足，以下為本案之簡要說明。
    本發明選擇四類化合物(亦稱生物活性物質)，包括醌類、二苯乙烯類、黃酮類及生物鹼類化合物，作為檢測中藥複方、中藥單方、食品、保健食品等產品的品管標準。尤其，本發明以醌類化合物中的大黃酸(rhein,4,5-dihydroxy-9,10-dioxoanthracene-2-carboxylic acid,式I)、番瀉苷A(sennoside A,(9R)-9-[(9R)-2-carboxy-4-hydroxy-10-oxo-5-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-9H-anthracen-9-yl]-4-hydroxy-10-oxo-5-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-9H-anthracene-2-carboxylic acid,式II)以及蘆薈大黃素(aloe-emodin,1,8-dihydroxy-3-(hydroxymethyl)anthracene-9,10-dione,式III)，二苯乙烯類化合物中的白藜蘆醇苷(resveratroloside,(2R,3S,4R,5R,6S,E)-2-(4-(3,5-dihydroxystyryl)phenoxy)-6-(hydroxy methyl)-tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol,式IV)，黃酮類化合物中的黃芩苷(baicalin,2S,3S,4S,5R,6S)-6-(5,6-dihydroxy-4-oxo-2-phenyl-4H-chromen-7-yloxy)-3,4,5-trihydroxy-tetrahydro-2H-pyran-2-carboxylic acid,式V)，以及生物鹼類化合物中的小檗鹼(berberine,9,10-dimethoxy-5,6-dihydro[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquino[3,2-a]isoquinolin-7-ium,式VI)及黃藤素(palmatine,2,3,9,10-tetramethoxy-5,6-dihydroisoquinolino[2,1-b]isoquinolin-7-ium,式VII)，作為檢測標的。以下為式I至式VII之化學結構式。

    本發明的檢測技術可用以檢測含有大黃、黃芩、黃連之複方藥物、含有大黃、黃芩或黃連之單方藥物，或其他中草藥樣品中是否存在至少一種前述的四類化合物或是存在至少一種前述的七種特定化合物。進一步，再檢測這些化合物類別或特定化合物在複方藥物、單方藥物或樣品中之比例。
    因此，本發明提供一種由一種產品分析一化合物之化學圖資之方法，該化合物包含至少一成份，包括大黃酸、番瀉苷A、蘆薈大黃素、白藜蘆醇苷、黃芩苷、小檗鹼及/或黃藤素，該分析方法包括步驟：(a)層析該產品之甲醇萃取物及對應該化合物之標準品；(b)比較該甲醇萃取物及該標準品之高效液相層析(HPLC)圖譜；(c)當該甲醇萃取物的HPLC圖譜出現大黃酸、番瀉苷A、蘆薈大黃素及/或白藜蘆醇苷的訊號時，表示該產品包含大黃；(d)當出現黃芩苷的訊號時，表示該產品包含黃芩；以及(e)當出現小檗鹼及/或黃藤素的訊號時，表示該產品包含黃連。
    本發明另一提供一種由一產品分析一化合物之化學圖資之方法，該化合物包括醌類化合物、二苯乙烯類化合物、黃酮類化合物及/或生物鹼類化合物，該方法包括步驟：(a)以HPLC分別層析該產品之甲醇萃取物及對應該化合物之標準品；(b)比較該甲醇萃取物及該標準品之HPLC圖譜；以及(c)根據比較結果來分析該產品之該化學圖資。
    根據上述構想，該方法還包括步驟：(a0)以甲醇溶液萃取該產品獲得甲醇萃取物，其中甲醇溶液的濃度介於50%至100%之間，該產品與甲醇溶液之重量/體積比為1：1。
    根據上述構想，步驟(b)還包括：比對甲醇萃取物之高效液相層析圖譜的吸收波峰與標準品之高效液相層析圖譜的吸收波峰。
    根據上述構想，步驟(b)還包括：比對甲醇萃取物之高效液相層析圖譜的滯留時間與標準品之高效液相層析圖譜的滯留時間。
    根據上述構想，該產品包含大黃、黃芩及/或黃連。而該產品包含1～3重量份的大黃、0.5～1.5重量份的黃芩及0.5～1.5重量份的黃連，或者，大黃、黃芩及黃連的重量份比例為2：1：1。此外，該產品使用大黃及黃蓮的乾燥根莖，及黃芩的乾燥根。
    本案所提出之發明將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得熟習本技藝之人士可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，熟習本技藝之人士仍可依據除既揭露之實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。 一、三黃瀉心湯在動物模式之安全性
    三黃瀉心湯臨床上最常見之副作用為腹瀉，若長期服用需考慮其安全性。本實驗研究服用不同三黃瀉心湯配方之小鼠是否發生腹瀉，以評估長期服用三黃瀉心湯之可行性。實驗小鼠為約30 g之C57BL/6小鼠，首先記錄其體重。第1週餵食劑量為9 mg/30 g體重/天之三黃瀉心湯給小鼠，並記錄每日體重，控制組小鼠並未餵食三黃瀉心湯。請參閱表1，在第1週後餵食三號配方(三黃瀉心湯3)之小鼠之糞便排遺以固態為主，小鼠體重並未顯著下降。第2週則餵食雙倍劑量(18 mg/30 g體重/天)之三黃瀉心湯給小鼠，並記錄每日體重。同樣地，並未發現小鼠體重顯著地下降，而且並未發現明顯的軟便或水狀腹瀉。因此，不同配方的三黃瀉心湯經長期服用並未導致體重下降，也不會造成瀉痢等副作用，可成為具安全性之中藥複方。
    二、製備三黃瀉心湯之甲醇萃取物
    本實驗使用包含大黃、黃芩、黃連之三黃瀉心湯粉末為材料，進行萃取獲得三黃瀉心湯萃取物，大黃、黃芩、黃連之乾藥材重量比為2：1：1。首先，將20 g乾燥之三黃瀉心湯粉末以1：1比例(重量/體積)置於50%甲醇溶液中，並以超音波震盪30分鐘。以濾紙過濾該混合液並收集過濾後之上清液，再以3,000 rpm離心該上清液15分鐘以去除沈澱物，將離心後之上清液濃縮乾燥並儲存於-4℃，此即為三黃瀉心湯甲醇萃取物。
    若以其他具有大黃、黃芩或黃蓮的中藥單方或中藥複方作為材料，亦是前述類似方法進行甲醇萃取物之製備。此外，大黃使用的是乾燥根莖，黃芩使用的是乾燥根，黃連使用的是乾燥根莖。大黃、黃芩、黃連之重量份介於1-3：0.5-1.5：0.5-1.5，甲醇溶液之濃度較佳之範圍介於50%至100%之間。本領域的技術人士可依實驗需要調整重量份比例及甲醇溶液濃度以調制出三黃瀉心湯粉末。 三、三黃瀉心湯之高效液相層析(HPLC)
    本實驗所使用之高效液相層析儀包括下列裝置：系統控制儀為LC-10A VP HPLC系統(Shimadzu,Kyoto,Japan)；幫浦為四元幫浦(LC-10AT)；溶媒除氣裝置為線上除氣裝置(DGU-14A)；自動注射儀為SIL-10AD；偵測器為光電二極體陣列偵測器(SPD-M10A)；層析管柱為安捷倫Poroshell 120 SB-C18 HPLC管柱(5 μm,150 mm×4.6 mm I.D.,Agilent Technologies,Inc.,U.S.A.)；樣品注射體積為10 μl。
    移動相由乙腈(溶劑A)及4 mM醋酸銨(溶劑B，利用甲酸調整酸鹼值至3.5)配製而成。管柱流速為0.6 ml/min，管柱溫度為室溫，偵測波長為254 nm。將各個獨立吸收峰的滯留時間與標準品進行比對並且將其作為三黃瀉心湯化學成分的鑑定依據。沖提梯度為：0.01～3分鐘為22%A～24%A；3～9分鐘為24%A～25%A；9～10分鐘為25%A～26%A；10～14分鐘為26%A～50%A；14～21分鐘為50%A～51%A；21～25分鐘為51%A～52.5%A；25～30分鐘為52.5%A～60%A。本領域的技術人士亦依實驗需要，將沖提梯度的時間及對應的溶劑A濃度作調整。
    7種標準品(式I至式VII)首先分別進行定性分析，確定每種化合物的滯留時間，之後再對三黃瀉心湯甲醇萃取物進行高效液相層析，以確定三黃瀉心湯每個獨立吸收波峰之滯留時間。藉由與標準品之比對，得到第1圖的三黃瀉心湯甲醇萃取物與7種標準品之高效液相層析圖譜以及表2之三黃瀉心湯甲醇萃取物7種化合物之滯留時間。
    三、大黃、黃芩、黃連之高效液相層析
    根據前述萃取方法及高效液相層析法，分別針對三黃瀉心湯之單方成分，即大黃、黃芩及黃連，製備出大黃甲醇萃取物、黃芩甲醇萃取物及黃連甲醇萃取物，將前述三種甲醇萃取物分別進行高效液相層析，確定前述三種甲醇萃取物之吸收波峰之滯留時間，將吸收波峰與上述7種標準品之吸收波峰進行比對，或者將滯留時間與上述7種標準品之滯留時間進行比對，得知前述三種甲醇萃取物是否含有標準品。請參閱第2圖，大黃甲醇萃取物之HPLC圖譜依序出現式III、式II、式I及式IV之吸收波峰，可知該大黃甲醇萃取物含蘆薈大黃素、番瀉苷A、大黃酸及白藜蘆醇苷。請參閱第3圖，同理，黃芩甲醇萃取物之HPLC圖譜出現式V之訊號，可知該黃芩甲醇萃取物含黃芩苷。由第4圖可知黃連甲醇萃取物含小檗鹼及黃藤素。
    此外，由於7種標準品分別具有特定的吸收波峰，因此，可將大黃酸、番瀉苷A及蘆薈大黃素之標準品混合成為醌類化合物(或稱為醌類標準品)，將白藜蘆醇苷之標準品定義為二苯乙烯類化合物(或稱二苯乙烯類標準品)，將黃芩苷之標準品定義為黃酮類化合物(或稱黃酮類標準品)，將小檗鹼及黃藤素之標準品混合成為生物鹼類化合物(或稱生物鹼類標準品)。將三黃瀉心湯複方、大黃單方、黃芩單方、黃連單方或複方進行甲醇萃取，將萃取物與醌類標準品、二苯乙烯類標準品、黃酮類標準品或生物鹼類標準品進行HPLC層析，並比較吸收波峰及滯留時間，以鑑定三黃瀉心湯、單方或複方中之各成份，以完成化學圖資分析。
    因此，本發明使用高效液相層析技術結合光電二極管陣列偵測器，以偵測中藥單方、複方等產品是否含醌類、二苯乙烯類、黃酮類或生物鹼類組合物等生物活性物質，以建立該等產品的化學圖資。
    本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由本領域技術人員做任何修改，但不脫離如所附申請專利範圍所要保護的範圍。
    第1圖為三黃瀉心湯與7種化合物(式I至式VII)比較之高效液相層析圖譜，其呈現7種化合物(式I至式VII)。
    第2圖為大黃單方之高效液相層析圖譜，其呈現大黃酸(式I)、番瀉苷A(式II)、蘆薈大黃素(式III)及白藜蘆醇苷(式IV)之吸收波峰。
    第3圖為黃芩單方之高效液相層析圖譜，其呈現黃芩苷(式V)之吸收波峰。
    第4圖為黃連單方之高效液相層析圖譜，其呈現小檗鹼(式VI)及黃藤素(式VII)之吸收波峰。
    权利要求:
    Claims (10)
    [1] 一種由一產品分析一化合物之化學圖資之方法，該化合物包含至少一成份，所述至少一成份係選自由一大黃酸、一番瀉苷A、一蘆薈大黃素、一白藜蘆醇苷、一黃芩苷、一小檗鹼、一黃藤素及其組合所組成的群組其中之一，該方法包括步驟：(a)層析該產品之一甲醇萃取物及對應該化合物之一標準品；(b)比較該甲醇萃取物及該標準品之高效液相層析圖譜；(c)當該甲醇萃取物之高效液相層析圖譜出現該大黃酸、該番瀉苷A、該蘆薈大黃素及該白藜蘆醇苷至少其中之一的訊號時，表示該產品包含一大黃；(d)當該甲醇萃取物之高效液相層析圖譜出現該黃芩苷的訊號時，表示該產品包含一黃芩；以及(e)當該甲醇萃取物之高效液相層析圖譜出現該小檗鹼及該黃藤素至少其中之一的訊號時，表示該產品包含一黃連。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該大黃酸、該番瀉苷A及該蘆薈大黃素屬於一醌類化合物，該白藜蘆醇苷屬於一二苯乙烯類化合物，該黃芩苷屬於一黃酮類化合物，以及該小檗鹼及該一黃藤素屬於一生物鹼類化合物。
    [3] 一種由一產品分析一化合物之化學圖資之方法，該化合物係選自由一醌類化合物、一二苯乙烯類化合物、一黃酮類化合物、一生物鹼類化合物及其組合所組成的群組其中之一，該方法包括步驟：(a)以一高效液相層析法分別層析該產品之一甲醇萃取物及對應該化合物之一標準品；(b)比較該甲醇萃取物及該標準品之高效液相層析圖譜；以及(c)根據比較結果來分析該產品之該化學圖資。
    [4] 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該產品包含至少一成份，該至少一成份係選自由一大黃、一黃芩及一黃連及其組合所組成的群組其中之一。
    [5] 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該產品包含1～3重量份的大黃、0.5～1.5重量份的黃芩及0.5～1.5重量份的黃連。
    [6] 如申請專利範圍第4項所述的方法，其中該大黃及該黃連使用乾燥根莖，以及該黃芩使用一乾燥根。
    [7] 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該醌類化合物係選自由一大黃酸、一番瀉苷A、一蘆薈大黃素及其組合所組成的群組其中之一，該二苯乙烯類化合物為一白藜蘆醇苷，該黃酮類化合物為一黃芩苷，以及該生物鹼類化合物為一小檗鹼及一黃藤素至少其中之一。
    [8] 如申請專利範圍第3項所述的方法還包括步驟：(a0)以一甲醇溶液萃取該產品獲得該甲醇萃取物，其中該甲醇溶液的濃度介於50%至100%之間，該產品與該甲醇溶液之重量/體積比為1：1。
    [9] 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該步驟(b)還包括：比對該甲醇萃取物之高效液相層析圖譜的吸收波峰與該標準品之高效液相層析圖譜的吸收波峰。
    [10] 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該步驟(b)還包括：比對該甲醇萃取物之高效液相層析圖譜的滯留時間與該標準品之高效液相層析圖譜的滯留時間。
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